Luminex 多因子样本收集、保存方法大汇总

正确的样本收集整理方法，是实验成功至关重要的步骤。目前Luminex 多因子技术可以检测样本类型有: 细胞上清、血清、血浆。尽管其他生物学样本没有经过验证，但是理论上也可以检测，这些样本包括: BAL，唾液，CSF，组织匀浆液和尿液等等。

下面我们针对几种常见样本类型提供一份样本收集、保存方法供大家参考：

血清

全血室温（20-25 °C）凝固20-30min；

室温1,000 x g 10min；

收集上清，或者选择使用血清分离器；

可选：如果样本是高血脂样本，请先在2-8℃10,000 x g 离心 10min，分离出下层血清；

多因子检测血清样本要求新鲜；如果不能在24h内检测，需要分装在-80℃保存，避免反复冻融。

血浆

根据要求选择柠檬酸或EDTA作为抗凝剂。如果选择肝素作为抗凝剂，建议每毫升血不超过10IU肝素（肝素用量过高，可能会导致部分检测指标值偏高）。

收集抗凝全血后30min内，在4℃下10,000 x g离心10min，分离收集血浆；

可选：如果样本是高血脂样本，请先在2-8℃10,000 x g 离心 10min，分离出下层血浆；

多因子检测血浆样本要求新鲜；如果不能在24h内检测，需要分装在-80℃保存，避免反复冻融。

细胞培养上清

细胞应处于对数生长期。在适当的细胞培养瓶中根据需要刺激细胞。使用无菌技术，用移液器吸移所需体积的条件细胞培养基，并将培养基转移到干净的聚丙烯微量离心管中。在冷冻微量离心机中，在4℃下以14000rpm将培养基离心10分钟，以去除细胞或细胞碎屑。将澄清的培养基等分至干净的聚丙烯微量离心管。这些样品即可用于检测。或者，可将澄清的培养基样品等分并储存在-80℃用于将来分析。避免多次冻融循环。将冷冻样品置于冰上使其解冻，并应在解冻后立即进行测试。分析前，解冻的样品应立即在冷冻微量离心机中通过离心（4℃下以14000rpm转速离心10分钟）澄清，以防止堵塞Luminex™探针和/或过滤板。遵循试剂盒提供的检测程序进行适当的稀释。

贴壁细胞裂解方法

1.    培养1×10⁶-1×10⁷个细胞；

2.   使用胰酶消化收集细胞

3.   将收集好的细胞转移至15ml圆形离心管，4ºC, 500g离心5min；

4.   小心去除上清，加入5ml预冷PBS重悬细胞，4ºC, 500g离心5min；重复步骤4；

5.   尽可能多的去除上清，小心不要碰到细胞沉淀。

6.   在上步骤获取的细胞中，加入200ul ProcartaPlex Cell Lysis Buffer（EPX-99999-000）。

7.   吹吸混匀8-10次，冰上孵育5min；

8.   将所有细胞转移到1.5ml离心管；

9.   4ºC, 14000g（离心机最大转速）离心10min；

10. 将上清转移到新管中。该上清可立即用于检测或者保存在-80ºC;

11.   按照多因子检测试剂盒操作方法检测。25ul细胞裂解液样本加入25ul Universal Assay Buffer（EPX-11111-000），作为一个样本加入到样本孔中。

悬浮细胞裂解方法

1. 培养1×10⁶-1×10⁷个细胞；

2. 将细胞转移到15ml圆形离心管，4ºC, 500g离心5min；

3.小心去除上清，加入5ml预冷PBS重悬细胞，4ºC,500g离心5min；

4. 尽可能多的去除上清，小心不要碰到细胞沉淀。

5.在上步骤获取的细胞中，加入200ul ProcartaPlex Cell Lysis Buffer（EPX-99999-000）。

6.吹吸混匀8-10次，冰上孵育5min；

7.将所有细胞转移到1.5ml离心管；

8.4ºC, 14000g（离心机最大转速）离心10min；

9.将上清转移到新管中。该上清可立即用于检测或者保存在-80ºC。

10. 按照多因子检测试剂盒操作方法检测。样本孔加入25ul细胞裂解液和25ul Universal Assay Buffer（EPX-11111-000）。

可选步骤：

建议细胞裂解后上清进行蛋白定量检测。

我们推荐使用Lowry法蛋白定量检测。

建议将所有样本使用预冷的ProcartaPlex Cell Lysis Buffer调整样本蛋白浓度为4-8 mg/ml。

组织样本裂解方案：
1． 收集组织样本-脾脏、肺、脑、肾脏、肝脏和心脏组织，称重。

2． 按照每100mg组织加入500ul ProcartaPlex Cell LysisBuffer （EPX-99999-000）。

3． 使用研磨、机械匀浆器、磁珠裂解等方法将组织进行裂解匀浆；

4． 4ºC，16000g 离心10min；

5． 将上清转移到新离心EP管中。

6． 使用蛋白定量试剂盒对上清进行蛋白定量。

7． 使用1*PBS把样本进行稀释到10mg/ml；

8． 按照多因子检测试剂盒Protocol进行检测。样本孔加入25ul Universal AssayBuffer（EPX-11111-000）和25ul 稀释后的组织上清液。

尿液

仅使用新鲜尿样。使用试剂盒中提供的检测稀释液将样品稀释2倍。样品的最终稀释度为4倍，所有结果均应乘以4。如果需要，在分析前通过离心（14000rpm，10分钟）和/或过滤来澄清样品，以防止堵塞过滤板和/或探针。

关节液

将关节液收集到非肝素化管中，并在样品采集的30分钟内以1000×g离心10分钟。在进行随后的分析之前，关节液的无细胞部分应储存在-80℃。分析前，所有样品需要通过离心（14000rpm，10分钟）和/或过滤来澄清，以防止堵塞过滤板。在加入检测之前，用检测稀释液以1：1稀释样品。参考文献：Raza K等人（2005） 关节炎研究与治疗7（4）: R784–R795。

脑脊液

分析前，所有样品需要通过离心（14000rpm，10分钟）和/或过滤来澄清，以防止堵塞过滤板。然而，CSF具有相对较低的粘度，并且除非存在感染状态（WBC的丰度），否则其不需要澄清并可以直接应用于检测。使用神经科学缓冲液试剂盒（货号LNB0001）中提供的检测稀释液稀释2倍。

支气管肺泡灌洗液

支气管肺泡灌洗（BAL）液应收集于无菌注射器中，并在分析之前持续保存于冰上。或者，可以将BAL等分至可用样品大小并冷冻（以便只会经历一次冻融）。分析前，所有样品需要通过离心（14000rpm，10分钟）和/或过滤来澄清，以防止堵塞过滤板。在应用于检测板之前，用检测稀释液稀释2倍。

宫颈分泌物

收集后，应立即将宫颈取样海绵放置于冰上。样品应在-20°C下储存长达一周，然后储存于-80°C直至做好检测准备。解冻后，应将海绵称重并放入Eppendorf管中，使用镊子进行转移，每次使用后用乙醇清洁。向每个管中加入200μL冰冷的提取缓冲液（配方见下文），并在4℃下孵育过夜。 然后将海绵和提取缓冲液转移到具有0.2μm醋酸纤维素过滤器的微量离心管中，并在4℃下以13000rpm离心10分钟。 然后测试洗脱液中的细胞因子表达。

提取缓冲液：50 mM HEPES，pH 7.5，1 mM Na3VO4，150mM NaCl，1 mM NaF，1 mM EDTA，0.1% Tween™ 20，25 mM EGTA ，10% 甘油

口腔粘膜渗出液

隔离牙齿周围的部位，将一张牙周滤纸插入牙齿周围的牙龈袋中，持续30秒。取出滤纸，在室温下使用50μL PBS提取4次，每次5分钟。每次提取物可以组合和单独进行分析。在应用于检测之前，用检测稀释液稀释2倍。

唾液

我们没有在内部专门测试过唾液样品。唾液含有多种蛋白水解酶。离心样品很重要，并且确保不要将任何细胞材料或碎屑吸移到检测板中。我们建议在样品中加入一些抗蛋白酶（例如，10到50 U / mL的Trasylol或抑肽酶），以保护蛋白质免受酶降解。您可以像处理上清液一样处理样品；遵循对细胞培养上清液进行检测所述的程序进行处理。