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酶联免疫斑点法——ELISpot

发表时间:2020-06-08 20:55

在免疫学研究领域中,对于疾病及疫苗的研究不仅仅局限于体液免疫应答,细胞介导的免疫应答(CMI)也是人们所关注的,而淋巴细胞在CMI中起关键作用。在研究细胞免疫应答保护作用及其机理方面,有多种研究方法可以使用,如:ELISpotELISA、流式细胞术以及定量RT-PCR etc

ELISpot原理

酶联免疫斑点法(The enzyme-linked immunospot ,ELISpot)是可以从细胞悬浮液中检测单细胞水平上细胞因子的分泌及抗体产生的一项细胞免疫学实验技术。 ELISpot 是一种定量实验,它的检测水平比传统酶联免疫吸附试验(ELISA)敏感20200倍。实际上,ELISpot 敏感性类似定量RT-PCR免疫学实验技术,但是ELISpot是检测蛋白分泌而不是表达 mRNA。由于ELISpot实验敏感性高、特异性精确性强,操作简单易行、成本相对较低而且ELISpot技术目前已经达到标准化、规范化的要求,在国际上已被广泛用于免疫功能检测,疾病诊断以及新的艾滋病毒疫苗的监控。

1. 特异性单抗包被在96ELISpot板内;

2. 加入细胞和刺激物;

3. 在培养过长中,细胞受刺激后分泌的蛋白质紧靠在细胞周围,被附近的包被抗体捕获。

4. 去除细胞,加入生物素标记的检测抗体,检测抗体和分泌的蛋白结合;

5. 加入碱性磷酸酶(ALP)或辣根过氧化物酶(HRP);

6. 加入显色底物,与酶发生显色反应,生成不可溶的色素,在细胞因子沉淀的部位形成斑点;

7. 斑点计数(人工计数或ElispotReader计数);数据处理和分析。

ELISpot技术的优势

酶联免疫斑点(ELISpot)技术是目前世界上检测生物体细胞免疫水平的最佳技术之一。ELISpot检测技术灵敏度高、重复性高、准确性强,能进行高通量、单细胞水平检测,在国内外免疫学界获得了广泛的应用,成为现代医学和生物学研究中主流免疫学检测技术之一。

Ÿ灵敏度高

理论上,ELISpot灵敏度高达百万分之一,即使在一百万个阴性细胞中只有一个阳性细胞,这个阳性细胞也能被检测出来。在ELISpot实验中, 一个阳性细胞表达一个斑点;所以一个斑点就证明一个阳性细胞的存在。即使这个阳性细胞混杂在一百万个阴性细胞中,ELISpot也能把这个阳性细胞检测出来 ELISpot的实际灵敏度已经远远超过流式仪检测和ELISA检测的精度。

Ÿ单细胞水平

与流式细胞仪技术一样,ELISpot也是一种单细胞水平的检测,而ELISA法、51Cr释放法、细胞增殖实验法都是群体水平的检测。群体细胞因子分泌水平的增加,可能是分泌细胞因子的细胞数量增加,也有可能是单个细胞分泌细胞因子水平增加。但是群体水平的检测不能区别出来两者不同,只有单细胞水平的检测能够胜任。这两种区别对于研究生物体的细胞免疫是很重要的。

Ÿ功能性检测

ELISpot检测到的细胞因子是细胞分泌出来的。斑点的强弱和数量反映了细胞对刺激物的反应能力和细胞分泌细胞因子的能力,这是体现细胞免疫反应的最重要的功能指标。而ELISA只能检测细胞培养上清液,充其量就是间接的反映了细胞功能;流式细胞内细胞因子染色法需要的把分泌出来的细胞因子人为的封闭在细胞内,只能反映细胞对刺激生产细胞因子的能力。此外,流式检测也不能去除一类假阳性细胞,这类细胞的细胞因子含量丰富,但是没有分泌功能。

Ÿ高通量

ELISpot检测是在96孔微孔板上进行的,是一种高通量的检测与筛选方法。经过培训的相关实验人员,一次实验可以处理上百份细胞样品与数十种抗原,来进行实验分析和处理。

Ÿ重复性及准确性高

冻存的细胞同样可进行ELISpot检测。由于经过冻存复苏淋巴细胞细胞并不丧失免疫功能(KyuSY, etc 2009 ,Smith JG, etc 2001),研究人员可以平行检测对比治疗前、后的病人血样,结果重复性好,准确度高。


ELISpot技术的应用

1. 疫苗研发

ELISpot检测已经成为评价疫苗细胞免疫反应最有效的指标之一Harrop R et. al., 2004。疫苗的保护效果可以分为两部分:体液免疫保护和细胞免疫保护。有效的疫苗不仅能够激发强烈的体液免疫,也能激发有效的细胞免疫(Holmgren J et. al., 1992b)。

Ÿ艾滋病疫苗研发与临床实验

艾滋病疫苗的主要功效应该表现在激起宿主病毒特异性的细胞免疫上。利用ELISpot检测细胞因子如IFN-g可以了解针对HIV特异的CTL应答及相关免疫信息。

Ÿ乙肝治疗性疫苗研究与临床试验

ELISpot技术来对乙肝疫苗的疗效进行评估,另外也用ELISPOT技术来研究这些疫苗服役不同佐剂,甚至药物(Dahmen, A. et. al., 2002)的免疫效果。

Ÿ癌症治疗性疫苗研究与临床试验

癌症的发生与发展是机体细胞免疫机能减弱的结果。增强机体针对癌细胞的特异性细胞免疫反应是癌症治疗的重要措施之一。这些治疗性肿瘤疫苗的疗效评估也离不开ELISPOT检测技术。

Ÿ其它疫苗研究

目前研发的疫苗包括HPV疫苗(Mahdavi, A. et. al., 2006)、HCV疫苗(et. al., 2006)、流感疫苗、禽流感疫苗、戊肝疫苗、SARS疫苗(Gillim-Ross, L. et. al.,2006)小儿偏肺病毒metapneumovirus疫苗(Buchholz, U. J.et. al.,2006)甚至包括自身免疫性疾病疫苗等等等等。

2. 临床应用

Ÿ结核病诊断

结核病诊断是ELISpot检测技术用到医学诊断领域的第一个成功典范。据世界卫生组织1999年统计,全球有1/3的人口感染过结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis),其中每年有8百万人发病,3百万人死亡(Dye, C. et. al., 1999)。更严重的是,结核病现在还有和艾滋病并发的趋势,使得治疗难上加难(Corbett, E. L. et. al., 2003)。诊断是治疗的前提,如果能够早期诊断,结核病的危害会小得多。

ELISpot技术带来了结核病早期诊断的革命。其一,由于ELISpot方法采用结核分枝杆菌特异性的多肽,可以避免卡介苗注射者的交叉反应;其二,由于ELISpot检测的是病人当下的细胞免疫水平,可以有效区别健康的TB携菌者与发病的TB活动病人

Ÿ型糖尿病诊断

I-型糖尿病属于自身免疫性疾病,该病患者自身的T细胞会攻击胰岛细胞,造成胰岛细胞的死亡和胰岛素的分泌不足。I-型糖尿病的ELISpot诊断即是用一道细胞特异性抗原刺激PBMC,根据IFN-γ阳性的频率判定自身免疫反应的强弱。文献表明,ELISpot诊断可以提供最终的判定依据(Meierhoff Get. al., 2002)。而对有糖尿病史的家族,做ELISpot检测,甚至可以在疾病发作之前5-10年作出预测(Karlsson Faresjo MG et. al., 2005Seissler J et. al., 2001)。这对于指导病人的日常生活,提高治疗效果有着重要的现实意义。

Ÿ其它自身免疫性疾病诊断

自身免疫性疾病大多数都是早期诊断困难,确诊要等到发病之后。但是一发病,身体各器官的伤害已经成为既定事实,治疗困难,并且往往很难恢复到正常水平。基于ELISpot技术的细胞免疫检测为这些疾病的早及诊断带来了曙光。文献表明,在多发硬化症(Moldovan IR et. al., 2005)、系统性红斑狼疮(Kalsi JK et. al.,2004)、牛皮癣/银屑病(Sigmundsdottir H t.al., 1997)、结核病(RestrepoBI 2004)、自身免疫性心肌炎(Maier R et. al., 2005)、自身免疫性感音性耳聋(Solares CA et. al., 2005)、风湿性关节炎(Klatt T et. al.,2005)、视神经脊髓炎(Correale J et. al., 2004)等等疾病的诊断、病因查找中,ELISPOT检测可以提供非常重要的信息,甚至成为最终指标。

3. 临床治疗指导与疗效评估

在人类的疾病谱中,有一大类或直接或间接与免疫系统相关。直接相关的包括各种免疫缺陷和自身免疫性疾病;间接相关的包括各种获得性免疫缺陷、免疫耐受、和获得性自身免疫疾病。针对这一类疾病的根本治疗措施是恢复人体正常的免疫机能,包括体液免疫机能与细胞免疫机能。评估各种药物、生物制剂和其它治疗手段的疗效,就要检测治疗前后病人的细胞免疫水平。相对临床采取的其它检测细胞免疫手段而言,ELISpot在临床治疗指导与疗效评估方面有独特优势和巨大的潜力。这些领域包括:乙肝治疗、癌症治疗、其它免疫相关性疾病治疗评估。

4. 器官移植

免疫排斥是器官移植最大的障碍,直接关系到手术的成功率和病人的预后。ELISpot检测可以全程参与到器官移植研究中去。

移植之前,可以用ELISpot对器官供体与受体做免疫相容性检测。如果HLA匹配,则供受体细胞之间相容性好,较少会刺激物斑点,提示移植手术成功率高,反之亦然。

在器官移植手术后,用ELISpot监视患者体内的免疫排斥反应,可以有针对性的用药,避免盲目的使用免疫抑制剂(Tung TH et. al., 2005)。这对于增加移植手术的成功率,延长移植器官的存活率,提高病人的生活质量意义重大(van Besouw NM et. al., 2005Tambur AR et. al., 2005)。类似的ELISpot免疫监视也见于基因治疗的病人(Whiteside TLet. al., 2003)。


5. 生物工程应用

ELISPOT技术还可以用于生物工程,成为一项生物工程技术。

ŸB细胞杂交瘤筛选

ŸT细胞表位肽筛选

Ÿ化合物与药物免疫性反应筛选

6. 基础研究

ELISpot技术本来就是在基础研究中创立和发展起来的。生物学和医学基础研究的日新月异,ELISPOT有不可磨灭的功勋。但也正是由于基础研究的快速发展,ELISpot的应用广,所以才难于分门别类。客观地说,在一切免疫学研究的前沿领域,ELISpot都是最有力的研究工具之一。比如研究人体的免疫系统功能,研究Th0/Th1/Th2细胞转换分析(Ott PA et. al., 2005),研究机体的过敏机制(Bordignon V et.al., 2005ChapovalSP et. al., 2002),研究癌症的免疫机制(Andersen MH et. al., 2005Alix-Panabieres C et. al., 2005),研究和筛选有效的T细胞表位肽(Anthony DD et. al.,2003)等,可谓名目繁多,不一而足。ELISPOT技术在基础研究方面所受的限制不在于技术本身,而在于我们的想象能力与创新思维。


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